Kỹ thuật realtime PCR sử dụng mẫu dò Taqman

Tương tự như PCR, realtime PCR cũng là kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào các chu kỳ nhiệt. Tuy nhiên, trong kỹ thuật PCR cần phải đợi PCR hoàn tất (end-point) mới tiếp tục sử dụng một số kỹ thuật khác, chẳng hạn như điện di sản phẩm PCR trên gel agarose mới có thể xác định sự hiện diện của trình tự khuếch đại. Còn trong kỹ thuật realtime PCR thì tín hiệu khuếch đại sẽ được hiển thị sau mỗi chu kỳ nhiệt, nhờ đó mà người thực hiện có thể theo dõi được kết quả PCR mà không cần đợi đến khi hoàn tất, cũng như không cần phải thực hiện thêm một số kỹ thuật khác.

Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR

Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR có trục tung (Y) là cường độ tín hiệu huỳnh quang đo được từ phản ứng PCR, còn trục hoành (X) là số chu kỳ nhiệt. Trong các chu kỳ đầu, tín hiệu huỳnh quang phát ra chưa đủ mạnh để máy có thể đo được, đường tín hiệu sẽ nằm ngang (gọi là tín hiệu nền). Khi số bản sao DNA đủ lớn, máy sẽ bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra, và tín hiệu lúc này sẽ tăng lên sau mỗi chu kỳ nhiệt, giai đoạn này gọi là giai đoạn lũy thừa (log phase). Đến một chu kỳ nào đó, phản ứng cạn kiệt nguyên liệu và enzyme Taq polymerase cũng không hoạt động hiệu quả nữa dẫn đến tín hiệu sẽ không tiếp tục gia tăng, giai đoạn này gọi là giai đoạn bình nguyên.

Trên biểu đồ khuếch đại có một thông số rất quan trọng đó là chu kỳ ngưỡng (Ct), đây là chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang trong ống PCR bắt đầu vượt qua đường tín hiệu nền. Trong phản ứng realtime PCR, tùy thuộc vào lượng mẫu ban đầu mà Ct sẽ xuất hiện sớm hay muộn. Mẫu ban đầu nhiều thì Ct sẽ xuất hiện sớm và ngược lại, mẫu ban đầu ít thì Ct sẽ xuất hiện muộn.

Đường chuẩn của realtime PCR

Khi đem một mẫu chuẩn có hàm lượng DNA đã xác định đi pha loãng bậc 10 liên tiếp, sau đó đem tất cả các nồng độ pha loãng đi chạy realtime PCR ta sẽ được các giá trị chu kỳ ngưỡng Ct khác nhau. Đường biểu diễn mối liên hệ giữa Ct và hàm lượng DNA được gọi là đường chuẩn realtime PCR, trên đường chuẩn sẽ có 2 thông số quan trọng cần quan tâm:

1) Hệ số tương quan R2 đánh giá độ chính xác của thao tác pipette, hệ số R2 càng gần giá trị 1 thì thao tác càng chính xác. Thông thường giá trị R2 ≥ 0.99.
2) Hiệu quả khuếch đại E, trong điều kiện lý tưởng giá trị E = 100%, tuy nhiên trong thực tế thì giá trị E chấp nhận được ở mức 90 – 105%.Dựa vào đường chuẩn và giá trị Ct của mẫu đầu vào, ta có thể định lượng chính xác hàm lượng DNA bên trong mẫu. Đây là ưu điểm vượt trội của realtime PCR khi so sánh với PCR, do trong kỹ thuật PCR thì tín hiệu được quan sát lúc phản ứng đã kết thúc nên cường độ tín hiệu không còn phản ánh tương quan chính xác với lượng DNA đầu vào nên không thể sử dụng cho định lượng.

Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan

Trong kỹ thuật realtime PCR, có nhiều cách khác nhau để tạo ra tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Bài viết lần này sẽ giới thiệu về cách dựa trên mẫu dò TaqMan, đây là một loại mẫu dò (probe) được sử dụng khá phổ biến trong kỹ thuật realtime PCR. Thành phần trong một phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan gần như tương đồng với một phản ứng PCR thông thường, ngoại trừ việc trong thành phần có chứa thêm mẫu dò TaqMan.

Mẫu dò TaqMan là một đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 24 – 30bp với đầu 5′ gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) và đầu 3′ còn lại gắn chất hấp thụ (quencher). Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh sáng huỳnh quang do reporter phát ra. Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq polymerase cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5′ – 3′ exonuclease, reporter được giải phóng tín hiệu huỳnh quang không còn bị quencher hấp thu (xem video bên dưới).

Mồi trong phản ứng realtime PCR thường có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55 – 60 oC và thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 – 10 oC để đảm bảo mẫu dò luôn bắt cặp trước. Trình tự đích lựa chọn cũng không nên dài quá 150bp để phản ứng diễn ra tối ưu nhất. Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan cũng chỉ có 2 giai đoạn:

1) Biến tính ở 94 – 95 oC trong 15 – 30 giây.
2) Bắt cặp và kéo dài ở 60 oC trong 30 – 60 giây.

Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR

1) Định lượng trình tự đích trong mẫu:

– Định lượng tuyệt đối: Sử dụng đường chuẩn realtime PCR và Ct của mẫu có thể tính được hàm lượng DNA trong mẫu (theo đơn vị số copy hoặc ng).
– Định lượng tương đối: Trong điều kiện lượng mẫu đầu vào là như nhau, mẫu có Ct nhỏ hơn thì sẽ có hàm lượng trình tự đích cao hơn. Tuy nhiên trong thực tế thì không có bằng chứng nào để khẳng định lượng mẫu đầu vào là như nhau, vì vậy cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gene chứng nội (IC), việc so sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc so sánh với IC. Đó là nguyên lý của phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt của Livak.

2) Định tính trình tự đích trong mẫu: Giống như PCR, realtime-PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, …. ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn (SNP), …

Các vấn đề thường gặp trong xét nghiệm bằng realtime PCR

1) Ngoại nhiễm sản phẩm PCR: Khi thực hiện realtime PCR nhiều lần thì môi trường xung quanh và hóa chất, dụng cụ, … cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm khuếch đại, do đó cũng cần khắc phục bằng dUTP kết hợp với enzyme UNG (xem thêm TẠI ĐÂY). Đồng thời luôn chạy kèm 1 mẫu chứng âm (sử dụng nước thay cho mẫu) để đánh giá tình trạng ngoại nhiễm.

2) Âm tính giả: Phản ứng realtime PCR có thể bị ức chế bởi các hóa chất, các thành phần khác có trong mẫu. Vì vậy cần có 1 mẫu chứng dương và các mẫu phản ứng nên chạy duplex PCR (target và IC) để đảm bảo âm tính không do các thành phần khác gây ra.